metodo di ricerca genetica molecolare

Per esplorare e identificare varianti nella struttura del DNA utilizzato metodo genetico molecolare. Per ciascuna regione di DNA, che esplora questa regione del cromosoma, gene o allele, i metodi differiscono. Sottostante ogni metodo genetica molecolare comprende alcuni o altra manipolazione di RNA e DNA. Tutti questi metodi sono caratterizzati da una enorme complessità, senza condizioni di laboratorio non possono essere eseguiti, e il personale deve essere altamente qualificato. Questo lavoro è eseguita in più fasi.

stadi

In primo luogo, campioni di RNA o DNA da produrre. Qui, un metodo genetico molecolare può essere applicato a qualsiasi materiale: una goccia di sangue, leucociti, fibroblasti cultura, mucosa (raschiato), anche i follicoli piliferi, – DNA può essere ottenuto da qualsiasi campione. E 'adatto per utilizzare qualsiasi metodo di genetica molecolare e le loro varie opzioni e hanno a lungo isolato il DNA si conserva congelata. La seconda fase è dedicata all'accumulo dei frammenti desiderati (amplificazione) di DNA, in quanto contribuisce a garantire la reazione a catena della polimerasi in vitro (in vitro senza coinvolgimento di organismo vivente). Come risultato, i selezionati moltiplica frammento di DNA di questa reazione a catena, e aumenta la quantità di DNA letteralmente milioni di volte.

Il terzo passo nei metodi di ricerca genetica molecolare presume moltiplicata restrizione del DNA (questa frammentazione, strappo o taglio). Restrizione eseguita mediante elettroforesi su una poliacrilammide o gel di agarosio. Questo metodo molecolare-genetico di studiare il frammento di DNA permette a ciascuno di prendere una certa posizione nel gel. Successivamente, il gel viene trattata con bromuro di etidio, capace di legarsi al DNA, l'irradiazione con luce ultravioletta, allora è possibile osservare porzioni di luminescenza. metodi diagnostici di genetica molecolare sono vari e numerosi, ma i primi due passi sono comuni a tutti. Ma per identificare frammenti di DNA, il gel può essere colorato, e molti altri metodi esistenti.

specie

I metodi più diretti e diffusi per micobatteri rilevamento possono comprendere il metodo di apprendimento DNA genetica molecolare sopra. La sua essenza è che, al fine di identificare il materiale catena di scansione dei frammenti specifici di DNA di agenti patogeni. tecniche diagnostiche di genetica molecolare non hanno ancora un modo più efficiente per riconoscere tali malattie come la tubercolosi. Utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR), si può essere sicuri che il DNA originale sarà aumentare il numero di copie in un milione di volte, cioè, ci sarà l'amplificazione, e visualizzerà i risultati. Il livello di sensibilità è molto elevata – più di novantacinque per cento, che è il principale vantaggio di questo metodo.

Il resto dei metodi molecolari genetiche di ricerca sull'efficacia della resa più copie letteralmente raddoppiato, poiché in questo caso il campione elaborazione mostra una specifica sequenza oligonucleotidica aumentata a cento e sei volte. Anche la diagnosi della tubercolosi cultura del sistema respiratorio inferiore significativamente la sua sensibilità. Questo è il motivo per cui la medicina moderna si basa su metodi di genetica molecolare di diagnosi di tubercolosi. Un metodo descritto è efficace soprattutto quando si tratta di agenti patogeni di elevata variabilità antigenica, determinare che altro modo è molto più difficile – richiede speciali supporti nutritivi e coltivare molto tempo. metodi genetici biochimici e molecolari producono effetto molto diverso sui risultati.

diagnosi della tubercolosi

Marshall PCR diagnosi della tubercolosi più comunemente usando quelle sequenze di DNA che sono specifici per tutti e quattro i tipi di malattia. Per raggiungere questo obiettivo spesso utilizzare primer che rilevano sequenza è elementi (IS-986, IS-6110), in quanto questi elementi caratterizzano specie altamente migratorie Mycobacterium tuberculosis e sempre presenti più copie nel genoma. Anche l'estrazione del DNA può essere effettuata da colture pure e clinica (espettorato dei pazienti) conformemente a qualsiasi altro metodo adatto. Per esempio, ci metodo Boom dove il tampone di lisi è utilizzato sulla base del tiocianato di guanidina e silice come il DNA vettore. Il numero di pazienti che si differenziano poveri batteriologica aumenta ogni anno, e quindi nella pratica clinica ha stabilito un livello completamente diverso di organizzazione: il metodo genetico-molecolare di studiare il DNA ha giocato un ruolo importante nella diagnosi.

Tuttavia, dobbiamo ammettere che non è senza inconvenienti. Il metodo PCR è l'uso di porta spesso un enorme numero di risultati falsi-positivi, e la ragione non è solo errori tecnici, ma anche le caratteristiche del metodo stesso. Inoltre, utilizzando questo metodo di diagnosi per determinare la vitalità dei micobatteri, che sono stati identificati, è semplicemente impossibile. Ma questo svantaggio non è il più importante. metodi genetici molecolari di diagnosi PCR comportano il rischio di contaminazione di DNA micobatteri. requisiti di certificazione per questo motivo che per i laboratori di PCR progettato esclusivamente difficile, hanno bisogno di tre locali separati. tecnologia PCR è moderno e molto complesso, che richiede l'uso di attrezzature adeguate e di personale di alto addestrato.

bacterioscopy

Quando i risultati di diagnosi delle analisi devono essere confrontati con altri dati: l'esame clinico, la radiografia, la microscopia striscio, tagliare e addirittura la risposta ad un trattamento specifico sono molto importanti. In questa serie, gli studi di PCR è soltanto uno dei componenti. Rileva l'agente patogeno nella diagnosi precoce può essere più semplici e veloci metodi – batteriologici.

Si impiega un microscopio ottico (colorazione Ziehl-Neelsen) e fluorescenti (fluorocromi coloranti). Il vantaggio è la velocità di striscio i risultati. Ma il suo svantaggio è giustamente considerata la capacità limitata a causa della bassa sensibilità. Tuttavia, questo metodo è dato raccomandazione OMS come il più economico e il terreno per rilevare pazienti tubercolosi. Rilevamento di micobatteri metodo batteriologico ha valore di predizione e stimato escrezione quantitativamente batterica. Molto più sicuro di trattare con esso molecolari metodi di ricerca genetica di tubercolosi.

culture

Meglio il rilevamento di micobatteri riconoscere studi culturali. Semina materiale patologico si è fatto nel mezzo uovo: Mordovsky, Finn II, LJ, e simili. I benchmark di resistenza dei micobatteri ai farmaci e una prova indiretta della efficacia di un certo numero di micobatteri e le loro colonie in vitro, se il metodo applicato della cultura della ricerca. Per aumentare la percentuale di isolamento di micobatteri inoculazione di materiale patologico si svolge su più ambienti.

Soddisfare le esigenze di numerosi eventi culturali, tra cui agente patogeno concessione e fluidi. Utilizzato in questo sistema e tipo di misurazione automatizzato crescita VANTES. Le colture devono essere tenuti in incubazione per un massimo di sette-otto settimane. A questo punto il raccolto con la mancanza di crescita può essere considerato negativo. Il modo più efficace per rilevare il Mycobacterium tuberculosis in considerazione campioni biologici: diagnostici cavie materiale infettare, che sono estremamente sensibili alla tubercolosi.

alcune cifre

interessante campo di studio, che è stato aperto dalla diagnostica di PCR è stato quello di studiare il M. tuberculosis – infezione latente. Il concetto moderno di infezione da TBC suggerisce che su cento persone che erano in contatto con M. tuberculosis, novanta può ben essere infettati, ma solo dieci di loro sono malattia attiva è in fase di sviluppo. Altri hanno TB immunità, e perché novanta per cento dei casi l'infezione rimane latente. Rilevare un modello che ha aiutato un metodo genetico molecolare.

I genetisti affermano che cinquantacinque per cento di coloro la cui colture patologica materiale sono stati negativi, e l'ottanta per cento delle persone infettate con M. tuberculosis, ma scorre senza manifestazioni radiografiche di malattie, PCR risposte positive ricevuto. Si tratta di un metodo diagnostico genetica contribuito a identificare i pazienti a rischio da studi di PCR, con i risultati delle loro analisi (microscopia e cultura) sono stati negativi, e l'infezione subclinica M. tuberculosis era presente.

ricerca moderna

La Federazione russa e laboratori batteriologici utilizzano un metodo accelerato delle concentrazioni assolute: l'attività della nitrato riduttasi di micobatteri testati da Griess reattivo. centri anti-TB utilizzano un metodo che permette di determinare la resistenza ai farmaci. Questo semina in terreni liquidi, dove automatizzato radiometrica e contabile fluorescente crescita dei micobatteri. Tale analisi è fatto rapidamente – fino a due settimane.

Attualmente, nuovi metodi sono stati sviluppati: resistenza ai farmaci di micobatteri è misurata a livello di genotipo. Studio dei meccanismi molecolari di geni di resistenza e indica la presenza di micobatteri. Questi geni sono associati a resistenza a certi farmaci. Ad esempio, i geni Kasa, inhA, katG resistente a isoniazide, gene rpoB – rifampicina geni RNA 16SP e rpsL – streptomicina, emb1 – a etambutolo, gyrA – un fluorochinolone e così via.

mutazioni

La diagnosi moderna ha aumentato significativamente il metodo di livello genetico-molecolare per lo studio del DNA e ha permesso di effettuare studi su larga scala di mutazioni in tutta la loro spettro. Ora sappiamo che le mutazioni più comuni nei 516, 526 e 531 codoni del gene rpoB ed ha identificato la resistenza ai vari farmaci. V'è tutta una serie di metodi per la tipizzazione dei micobatteri che utilizzano non solo i metodi tradizionali – biochimici, biologici e culturali, ma anche ampiamente utilizzato tecniche di genetica molecolare moderne. Già ci sono adeguate e forniscono il metodo diagnosi corretta per l'individuazione di malattie monogeniche. Essi si basano su studi sul DNA nella zona esatta di un particolare gene. Questo è di solito un processo complesso, lungo e costoso, ma i dati che fornisce analisi genetica molecolare, è molto più preciso e informativo rispetto ai dati di tutte le analisi.

E 'noto da tempo che il DNA non cambia per tutta la vita dell'organismo che è in ogni cellule odnakova nucleata, e questo rende possibile prendere l'analisi di assolutamente tutte le cellule del corpo, in qualsiasi fase di ontogenesi. Il gene danneggiato può essere rilevato prima della comparsa dei primi sintomi della malattia clinica su larga scala, come pure in persone eterozigoti sani, ma avere una mutazione nel gene. metodi diagnostici malattia ereditaria genetica molecolare permettono di rivelare i suoi (approccio diretto, DNA-diagnostica), nonché per analizzare la segregazione della malattia in famiglia con pennarello loci del DNA (polimorfismi genetici), che sono strettamente collegati con un gene danneggiato (ad esempio, l'approccio indiretto del DNA diagnostica). Direttamente o indirettamente – qualsiasi diagnostica del DNA si basa sui metodi di identificazione una parte strettamente definita del DNA umano.

metodi diretti

Metodi diretti di DNA diagnosi sono quando la malattia ereditaria gene colpevole è noto, come ben noto, e tipi di sue mutazioni. Ad esempio, un adatto metodi diretti in una serie di malattie. Questo corea di Huntington (estensione CTG-ripetizioni), fenilchetonuria (R408W), fibrosi cistica (delF508, grandi mutazioni) e simili. Il vantaggio principale del metodo diretto è un'accuratezza diagnostica interamente di proprietà, e non c'è bisogno di fare un analisi del DNA del resto della famiglia. Se viene trovata una mutazione nel gene corrispondente, permette esattamente approvare una diagnosi di ereditarietà, la determinazione del genotipo per il resto della famiglia gravata.

Un altro vantaggio di una diagnosi diretta è considerato per identificare un portatore eterozigote di cattive mutazioni di parenti e genitori che sono morti a causa della malattia. Ciò è particolarmente vero per le malattie autosomiche recessive. Svantaggi di metodi diretti sono inoltre disponibili. Per applicare loro, è necessario sapere esattamente localizzare il gene anomalo, la struttura esone-introne del suo spettro e le sue mutazioni. Non tutte le malattie monogeniche oggi hanno ricevuto tali informazioni. metodi diretti informatività non può essere considerata completa, perché uno stesso gene può avere un gran numero di mutazione patologica che provoca lo sviluppo di malattie ereditarie.

metodi indiretti

I metodi indiretti nella diagnostica del DNA siano utilizzate a tutti, in altri casi, se il gene danneggiato non è identificato, ma solo cromosomicamente, o se la diagnosi linea non ha dato il risultato (succede, se il complesso gene organizzazione molecolare o in gran parte, se ci sono un sacco mutazioni patologiche). I metodi indiretti eseguite analisi di segregazione di marcatori polimorfici in famiglia allelica. Marcatori trovati nella stessa regione cromosomica o locus è strettamente legata alla malattia e rappresentano delezioni o inserzioni, sostituzioni punto, ripetizioni, e il loro polimorfismo è dovuta alla differente quantità di cellule nel blocco.

Il più conveniente per la diagnosi considerato microsatelliti e minisatellite polimorfismi indiretti, che sono ampiamente distribuiti nel genoma umano. il loro valore espresso in alto contenuto informativo, se il danno alla distanza genetica tra il marcatore e il gene non è troppo grande. In quest'ultimo caso, la precisione di stima è determinata in larga misura la frequenza di ricombinazione tra il marcatore polimorfico e danni. metodi diagnostici indiretti forniscono anche passo preliminare obbligatorio di frequenze alleliche dello studio popolazione analizzata tra i pazienti ei portatori di mutazioni, più la necessità di determinare la probabilità di ricombinazione dei marcatori di non equilibrio e di adesione e alleli mutanti.

altri metodi

segmenti corti di RNA o DNA, così come singolo gene visualizzati in esame microscopico non possono essere, quindi, per identificare mutazioni necessarie per la diagnosi genetica molecolare. C'è un "Progetto Genoma Umano", così come altri progressi nella genetica molecolare notevolmente ampliata la possibilità della diagnosi di malattie ereditarie – sia pre- e post-natale. Questi metodi possono fornire diagnosi precoce e fare una poli- previsione e malattie monogeniche, il cui debutto avviene in età adulta. Sfortunatamente, a causa delle capacità tecniche di studi di genetica molecolare sono talvolta oltre i limiti etici impostati in relazione alla successione, specialmente quando la diagnosi è in adolescenza e l'infanzia.

anomalie cromosomiche strutturali e numeriche sono le cause più comuni della malattia e il cancro, e molti malformazioni. aberrazioni cromosomiche devono essere identificati, che è importante per la famiglia di consulenza – per valutare le previsioni, insieme a rischio riproduttivo nelle gravidanze future. analisi cromosomica è il "gold standard" della diagnosi genetica, ma è limitata. Solo i metodi di analisi genetica molecolare può fare di più, perché c'erano clonazione etichette fluorescenti tecnologia basata capaci di loro elevata sensibilità per identificare le modifiche cromosomiche sottili che sono impossibili da rilevare classici studi citogenetici. Queste tecniche sono sempre più espandendo le nostre capacità diagnostiche, quando ha esaminato, i bambini con disabilità dello sviluppo, ritardo mentale, con molte altre malattie ereditarie.

risultati

E 'molto importante per l'umanità erano la struttura genica e la funzione della conoscenza, tipi di variabilità, la capacità di rilevare malattie ereditarie che si sono verificati in relazione allo sviluppo della genetica molecolare. i suoi metodi sono finalizzate allo studio della molecola del DNA – e quando è normale, e quando è danneggiato. Preparazione di sequenze di acidi nucleici di nucleotidi (DNA) si estende in fasi di ricevere campioni per identificare singoli frammenti. Isolamento del DNA genomico dalle cellule, restrizione (strappo), amplificazione (clonazione), elettroforesi dei frammenti (separando loro carica elettrica e il peso molecolare in gel di agarosio). Identificazione di frammenti specifici situati sulla superficie di una striscia discreta.

Poi entrare nei filtri speciali atto, attraverso il quale passa ogni ibridazione frammento con frammenti di DNA clonati o sonde radioattive sintetici è un controllo, che sarà pari a ciascun campione di prova. Se si cambia la posizione o la lunghezza rispetto con la sonda, se un nuovo frammento o scomparsi – tutto questo suggerisce che il gene analizzato è stato sottoposto a ristrutturazione nella sequenza nucleotidica. Ci sono otto tecniche di base di studi di genetica molecolare: sequenziamento (determinazione della sequenza di DNA), reazione a catena della polimerasi (aumento del numero di sequenze), la preparazione di primer geni conosciuti, la clonazione del DNA, produzione di molecole ricombinanti derivate proteine dovuto a molecole ricombinanti, creando un set completo (collezione biblioteca) frammenti che sono stati ottenuti utilizzando restrizione clonato.