Microscopia a fluorescenza: principi del metodo

Assorbimento e riemissione di ulteriori fluidi inorganici e organici luce è il risultato di fosforescenza o fluorescenza. La differenza tra il fenomeno è la durata dell'intervallo tra assorbimento ed emissione di flusso luminoso. Quando la fluorescenza di questi processi si verificano quasi contemporaneamente, mentre la fosforescenza – con un certo ritardo.

informazioni storiche

Nel 1852, lo scienziato britannico Stokes, descritta per la prima fluorescenza. Ha introdotto un nuovo termine a seguito di esperimenti con fluorite, che emettono luce rossa sotto la luce ultravioletta. Stokes ha notato un fenomeno interessante. Si trova che la lunghezza d'onda della radiazione fluorescente è sempre maggiore della portata della luce di eccitazione.

Per confermare l'ipotesi nel 19 ° secolo ci sono stati molti esperimenti. Essi hanno dimostrato che una varietà di campioni fluorescenza sotto l'influenza della luce ultravioletta. Tra i materiali, tra le altre cose, state cristalli, resine, minerali, clorofilla, farmaci grezzi, composti inorganici, vitamine, oli. L'uso diretto di coloranti per test biologici è iniziata solo nel 1930,

Microscopia a fluorescenza: Descrizione

Alcuni dei materiali utilizzati nella prima metà degli studi del 20 ° secolo esposti elevata specificità. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Grazie alle prestazioni, che non potrebbe essere raggiunto con i metodi di contrasto, il metodo di microscopia a fluorescenza è diventato uno strumento essenziale nella ricerca biomedica e biologica. Altrettanto importanti risultati sono stati ottenuti, e per i materiali.

? Quali sono i vantaggi del metodo di microscopia a fluorescenza? Utilizzando nuovi materiali è diventato possibile e la scelta dei componenti submicroscopiche cellulari altamente specifico. Microscopia a fluorescenza in grado di rilevare singole molecole. Una varietà di coloranti permettono l'identificazione di più articoli contemporaneamente. Nonostante la risoluzione spaziale limitata del limite di diffrazione delle apparecchiature, che, a sua volta, dipende dalle proprietà specifiche del campione, l'identificazione di molecole di sotto di questo livello è anche abbastanza possibile. Vari campioni dopo irradiazione mostre autofluorescenza. Questo fenomeno è ampiamente usato in petrology, botanica, l'industria dei semiconduttori.

lineamenti

Studiare tessuti animali o agenti patogeni spesso complicati o troppo deboli o molto forti autofluorescenza non specifico. Tuttavia, il valore in studi acquisisce introduzione nelle componenti materiali eccitati ad una specifica lunghezza d'onda ed emettendo l'intensità del flusso luce necessaria. Fluorocromi agiscono come coloranti in grado di indipendentemente collegati a strutture (visibile o invisibile). Così essi hanno un'alta selettività al bersaglio, e la resa quantica.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Microscopia a fluorescenza è stato ampiamente utilizzato dopo l'avvento di coloranti naturali e sintetici. Essi possedevano alcuni profili di intensità di emissione e di eccitazione e mirati a specifici target biologici.

Identificazione delle singole molecole

Spesso, in condizioni ideali, è possibile registrare un bagliore elemento separato. Per questo, tra le altre cose, è necessario fornire una sufficientemente basso rumore del rivelatore e lo sfondo ottico. molecola fluoresceina al fallimento a causa di photobleaching in grado di emettere fino a 300 mila. I fotoni. Al efficienza di raccolta del 20% del processo e li può registrarsi in un importo di circa 60 mila.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Microscopia a fluorescenza basato su fotodiodi a valanga o moltiplicazione elettronico, ha permesso ai ricercatori di osservare il comportamento delle singole molecole attraverso il secondo, ed in alcuni casi addirittura minuti.

complessità

Una questione chiave a favore della soppressione del rumore di fondo ottico. A causa del fatto che molti dei materiali utilizzati nella progettazione di filtri e lenti esporre alcuni autofluorescenza, gli sforzi degli scienziati nelle fasi iniziali erano orientate alla produzione di componenti aventi una bassa fluorescenza. Tuttavia, esperimenti successivi hanno portato a nuove conclusioni. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. In particolare, si è riscontrato che la microscopia a fluorescenza, basato sulla riflessione interna totale, permette di ottenere una bassa bassa e alta intensità della luce di eccitazione.

meccanismo

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. I principi della microscopia a fluorescenza, sulla base di riflessione interna totale è l'uso di onda evanescente o evanescente. Essa si verifica al confine tra media con differenti indici di rifrazione. In questo caso, il fascio luminoso attraversa il prisma. Ha un parametro di elevato indice di rifrazione.

Il prisma adiacente alla soluzione acquosa o vetro a bassa parametro. Se un fascio di luce diretta a esso ad un angolo che è più critica, il raggio è completamente riflessa dall'interfaccia. Questo fenomeno, a sua volta, provoca onde nonpropagating. In altre parole, il campo elettromagnetico generato che penetra in un mezzo con un parametro più basso indice di rifrazione a una distanza inferiore a 200 nanometri.

L'onda evanescente intensità della luce sarebbe sufficiente a eccitare fluorofori. Tuttavia, a causa della sua estremamente piccola profondità, il suo volume sarà molto piccolo. Il risultato è uno sfondo di basso livello.

modifica

microscopia a fluorescenza si basa sulla riflessione interna totale, può essere implementata con epi-illuminazione. Ciò richiede lenti con elevata apertura numerica (almeno 1,4, ma è desiderabile che ha raggiunto 1,45-1,6), e parzialmente illuminato apparato campo. Quest'ultimo è realizzato con una dimensione piccola macchia. Per una maggiore uniformità utilizzando un sottile anello, che è bloccato da una porzione del flusso. Per l'angolo critico, dopo che v'è una riflessione totale, è necessario un elevato livello di rifrazione del mezzo di immersione nella lente e il vetro di copertura del microscopio.